正在試運(yùn)行中
AFADESI-MSI是一種新型的常壓敞開(kāi)式離子化技術(shù)，無(wú)需放射性同位素或熒光標(biāo)記，通過(guò)與高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)機(jī)使用，可直觀反映目標(biāo)分子或者未知化合物分子在生物體內(nèi)的原位代謝信息，能夠解決具有空間分布差異或者結(jié)構(gòu)差異相關(guān)的生物學(xué)問(wèn)題。該技術(shù)借助于高速的空氣流，實(shí)現(xiàn)了離子的遠(yuǎn)距離傳輸，擴(kuò)展了待測(cè)樣品的檢測(cè)空間和靈活性，靈敏度可達(dá)pg級(jí)別，動(dòng)態(tài)范圍達(dá)到三個(gè)數(shù)量級(jí)，覆蓋1500個(gè)化合物，如膽堿類(lèi)、多胺類(lèi)、氨基酸類(lèi)、肉堿類(lèi)、核苷類(lèi)、核苷酸類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、碳水化合物類(lèi)、膽固醇類(lèi)、膽酸類(lèi)、脂質(zhì)類(lèi)等多種類(lèi)代謝物。
中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室再帕爾·阿不力孜、賀玖明團(tuán)隊(duì)在分析化學(xué)一區(qū)《Analytical Chemistry》期刊發(fā)表封面文章，題為“Mapping Metabolic Networks in the Brain by Ambient Mass Spectrometry Imaging and Metabolomics”的研究成果，采用自主研發(fā)的AFADESI-MSI技術(shù)，建立了一種高靈敏空間代謝組學(xué)方法，實(shí)現(xiàn)了大鼠腦組織中多種類(lèi)極性?xún)?nèi)源性代謝物的高覆蓋成像，結(jié)合代謝通路分析，全面繪制腦代謝網(wǎng)絡(luò)圖譜，揭示了東莨菪堿致大鼠記憶功能障礙模型的代謝改變及其腦微區(qū)分布特征。（文章鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c00467）
大腦功能與其復(fù)雜的微區(qū)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。研究腦中分子變化有助于理解中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制，推動(dòng)藥物研發(fā)。質(zhì)譜成像(MSI)技術(shù)具有高靈敏、方便、省時(shí)以及免標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)，已成為繪制蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和脂質(zhì)圖譜的強(qiáng)大工具，但高通量成像表征腦中的極性小分子代謝物仍具挑戰(zhàn)。本文對(duì)課題組研發(fā)的空氣動(dòng)力輔助離子化質(zhì)譜成像（AFADESI-MSI）平臺(tái)進(jìn)行了優(yōu)化，應(yīng)用空間分辨代謝組學(xué)繪制了大鼠腦代謝網(wǎng)絡(luò)。
SD大鼠腹腔注射2 mg/kg東莨菪堿（給藥組、對(duì)照組各3只），安樂(lè)死后取出大腦，用冷凍切片機(jī)制成20 μm厚的矢狀切片，相鄰的大腦切片進(jìn)行H&E和Nissl染色。
SD大鼠腹腔注射2 mg/kg東莨菪堿（給藥組、對(duì)照組各3只），安樂(lè)死后取出大腦，用冷凍切片機(jī)制成20 μm厚的矢狀切片，相鄰的大腦切片進(jìn)行H&E和Nissl染色。
原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后應(yīng)用MassImager軟件進(jìn)行可視化。將光學(xué)圖像精準(zhǔn)匹配感興趣區(qū)域的離子強(qiáng)度，獲取差異代謝物信息。通過(guò)在線(xiàn)數(shù)據(jù)挖掘工具M(jìn)etaboanalyst完成了代謝物的高通量注釋。Cyctoscape用于可視化大腦中的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。
兩組大腦樣本選擇相同的微區(qū)進(jìn)行組織學(xué)特征性離子圖像疊加，采用t檢驗(yàn)(n = 3)進(jìn)一步驗(yàn)證數(shù)據(jù)處理結(jié)果。
研究通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定ACN / H2O（8:2）作為理想的噴霧溶劑。圖像中小腦小葉間隔（約為78.0 μm）清晰可見(jiàn)，表明AFADESI-MSI的實(shí)際空間分辨率小于100 μm。此外，成像結(jié)果顯示質(zhì)量差為30ppm的兩種代謝物可以得到明顯分離，檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍高達(dá)1000倍。如圖所示，通過(guò)AFADESI-MSI獲得的一些具有代表性的代謝物，離子強(qiáng)度從0~106，其分布特征與腦功能結(jié)構(gòu)高度一致。
圖1. AFADESI-MSI和代謝組學(xué)繪制大鼠大腦代謝網(wǎng)絡(luò)的策略，以及代表性極性?xún)?nèi)源性代謝物離子圖像。
實(shí)驗(yàn)通過(guò)AFADESI-MSI在正負(fù)離子模式下獲得了298和372個(gè)特征離子圖像。包括氨基酸、核苷酸、碳水化合物、脂肪酸和神經(jīng)遞質(zhì)（NTs）等。結(jié)果顯示γ-氨基丁酸（GABA）在中腦、嗅球和下丘腦中信號(hào)強(qiáng)度較高；多巴胺（DA）主要集中分布在紋狀體；組胺（HA）作為一種興奮性NTs集中在丘腦和下丘腦中。松果體在睡眠和光周期調(diào)節(jié)方面起著重要的作用，由于其體積小容易被忽視。實(shí)驗(yàn)在該區(qū)域檢測(cè)到共106種極性代謝物，發(fā)現(xiàn)吲哚乙醛、吲哚、5'-甲基硫代腺苷和褪黑素高表達(dá)，且褪黑素上游代謝產(chǎn)物血清素(5-HT)在松果體中也有特定的分布。
圖2.AFADESI-MSI和MetaboAnalyst獲得的大鼠腦中的代謝網(wǎng)絡(luò)。
研究將光學(xué)圖像和MSI圖像進(jìn)行精確疊加，從大腦微區(qū)中提取代謝圖譜進(jìn)行代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)。圖中顯示了包括谷氨酸代謝、花生四烯酸代謝、葡萄糖代謝、嘌呤代謝、三羧酸循環(huán)等在內(nèi)的代謝途徑。這些信息有助于在系統(tǒng)水平上深入了解大腦的代謝活動(dòng)。如圖3A所示，嘌呤代謝中，AMP和GMP在大腦皮層和松果體中高表達(dá)，但在胼胝體和穹隆中強(qiáng)度較弱。這些結(jié)果表明，代謝物的分布在大腦中表現(xiàn)出功能區(qū)域特異性。
圖3.AFADESI-MSI獲得大鼠腦內(nèi)嘌呤代謝途徑及相關(guān)代謝產(chǎn)物分布(A)和AMP在大鼠腦各層的分布(B)。
如圖展示了NTs及其相關(guān)代謝物在大鼠腦內(nèi)的分布特征和聯(lián)系。結(jié)果表明代謝物在腦微區(qū)結(jié)構(gòu)中的代謝速度是可變的，并定義了區(qū)域內(nèi)穩(wěn)態(tài)的條件。如組氨酸作為組胺（HA）的前體在松果體中分布稍高，而HA僅在丘腦和下丘腦中觀察到；HA代謝下游產(chǎn)物甲基組胺在丘腦和下丘腦中的分布比HA更廣泛，從而進(jìn)一步證明了代謝網(wǎng)絡(luò)的區(qū)域多樣性和復(fù)雜性。
圖4.(A)神經(jīng)遞質(zhì)及其相關(guān)代謝物在大鼠腦中的分布;(B)神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)和代謝網(wǎng)絡(luò)。
研究應(yīng)用AFADESI-MSI分析了對(duì)照組和東莨菪堿治療的大鼠腦矢狀切片。顯示了差異代謝物在不同腦微區(qū)的含量，如N-甲酰犬尿氨酸、L-色氨酸和5-HTP這三種代謝物同屬于色氨酸代謝通路，表明東莨菪堿擾亂了腦區(qū)色氨酸代謝過(guò)程或相關(guān)代謝物的區(qū)域間轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，NTs調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)也受到了干擾，腦導(dǎo)管內(nèi)HA和甲基組胺升高， GABA、Glu、谷胱甘肽也發(fā)生變化。對(duì)給藥組大腦的10個(gè)微區(qū)進(jìn)行了分析，結(jié)果在腦橋中發(fā)現(xiàn)16個(gè)異常代謝物，而在大腦皮質(zhì)中發(fā)現(xiàn)7個(gè)異常代謝物，表明腦橋和大腦皮質(zhì)可能是對(duì)東莨菪堿作用最敏感的區(qū)域。
圖5.東莨菪堿模型大腦中代謝網(wǎng)絡(luò)改變。
如下圖所示，顯示了其中幾種異常表達(dá)的代謝產(chǎn)物的分布，如腺嘌呤在小腦皮層發(fā)生顯著下調(diào);HA在腦導(dǎo)水管下調(diào) (圖6A-H)。這些代謝物的相對(duì)定量信息進(jìn)一步表明，藥物效應(yīng)在大腦中具有多樣性和區(qū)域特異性?；诳臻g分辨的代謝組學(xué)為發(fā)現(xiàn)酶或基因異常提供了線(xiàn)索，但要完成完整的代謝網(wǎng)絡(luò)分析需要在蛋白質(zhì)和基因水平上進(jìn)一步驗(yàn)證。
圖6.東莨菪堿治療大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙腦模型的AFADESI-MSI圖像和代謝物統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n = 3)。
本研究開(kāi)發(fā)了一種針對(duì)極性?xún)?nèi)源性代謝小分子高靈敏、高覆蓋的分子成像方法，通過(guò)AFADESI-MSI空間代謝組學(xué)分析，全面繪制了腦代謝網(wǎng)絡(luò)及其空間分布，無(wú)需衍生化和復(fù)雜的前處理，實(shí)現(xiàn)了對(duì)NTs、核苷酸代謝物、多胺、肌酸等極性分子的可視化，為腦中生理、病理和藥理過(guò)程的機(jī)制、功能、以及神經(jīng)系統(tǒng)中各區(qū)域間的相互聯(lián)系提供了線(xiàn)索和代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究的新視角。本文運(yùn)用該方法進(jìn)一步研究了東莨菪堿模型腦的微區(qū)代謝變化，結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析，揭示了與記憶功能障礙直接相關(guān)的代謝通路顯著改變及其微區(qū)分布特征。
數(shù)據(jù)來(lái)源：“質(zhì)譜成像”微信公眾號(hào)
中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室再帕爾·阿不力孜、賀玖明團(tuán)隊(duì)在《PNAS》上發(fā)表了一篇題為“Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations”的研究論文，采用AFADESI-MSI技術(shù)，建立了空間分辨的原位代謝組學(xué)方法，并提出一種“下游代謝物與上游代謝酶關(guān)聯(lián)” 的研究策略來(lái)表征腫瘤代謝改變；結(jié)合免疫組化分析驗(yàn)證，從代謝物和代謝酶兩個(gè)層次和組織原位深入探究食管癌的代謝改變，發(fā)現(xiàn)并可視化表征了食管癌異常的代謝通路及其代謝酶。（文章鏈接：https://doi.org/10.1073/pnas.1808950116）
獨(dú)特的代謝模式是腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的重要特征，越來(lái)越多的研究表明，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)發(fā)生特定譜式的代謝改變以適應(yīng)腫瘤生長(zhǎng)。對(duì)于不同組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞，盡管彼此間的基因變異譜千差萬(wàn)別，但是，幾乎所有的腫瘤都需要通過(guò)類(lèi)似的代謝重編程（Metabolic Reprogramming）來(lái)維持其無(wú)限制的細(xì)胞增殖。腫瘤代謝的表征能夠?yàn)榘┌Y病理機(jī)制研究、腫瘤診療新指標(biāo)和干預(yù)靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供新的契機(jī)。然而，到目前為止，如何全面的發(fā)現(xiàn)腫瘤的異常代謝，尤其是如何從代謝物和代謝酶兩個(gè)層面上原位地表征腫瘤的異常代謝仍然面臨非常大的困難。
收集256例人鱗片狀食管癌（ESCC）組織標(biāo)本，包括癌組織、癌旁組織和遠(yuǎn)端非癌組織，制成冰凍組織切片。如圖1所示，采用空氣動(dòng)力輔助解吸電噴霧離子化質(zhì)譜成像技術(shù)（AFADESI-MSI），采集上述組織中內(nèi)源性代謝物及其空間分布信息；對(duì)相鄰切片進(jìn)行HE染色；采用MassImager質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)處理軟件，使質(zhì)譜成像圖與HE染色圖匹配重合，按不同組織類(lèi)型及空間分布提取代謝物輪廓信息；使用SIMCA軟件進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析，篩選出與腫瘤代謝相關(guān)的差異代謝物；根據(jù)差異代謝物及其鑒定結(jié)果富集分析發(fā)生變化的代謝通路及推測(cè)關(guān)鍵代謝酶；采用免疫組化方法檢測(cè)鎖定的代謝酶表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證其與代謝標(biāo)志物是否具有同樣的空間分布特征。
脯氨酸作為細(xì)胞微環(huán)境中的重要氨基酸參與細(xì)胞凋亡和自噬，在癌癥代謝中的重要作用得到越來(lái)越多的關(guān)注。根據(jù)256個(gè)食管癌組織樣本的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，癌區(qū)脯氨酸離子強(qiáng)度顯著高于上皮和肌肉區(qū)(P<0.001，圖2C)。采用免疫組化方法檢測(cè)與脯氨酸合成相關(guān)的關(guān)鍵代謝酶吡咯-5-羧酸還原酶2（PYCR2）在ESCC組織切片中的空間表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PYCR2只在癌區(qū)表達(dá)(圖2e)，與食管癌組織中脯氨酸的空間分布一致。
圖2 脯氨酸生物合成途徑中關(guān)鍵代謝物和代謝酶的原位分析（A）脯氨酸的質(zhì)譜成像（B）光學(xué)-MSI重疊圖像（C）256例鱗片狀食管癌（ESCC）患者癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中脯氨酸水平 ***p<0.001（D）ESCC組織的HE染色圖 （E）不同ESCC組織中PYCR2的表達(dá) CT，癌組織；ET，上皮組織；MT，肌肉組織
尿苷是RNA合成的重要核苷前體，也參與嘌呤核苷酸生物合成和碳水化合物代謝。此外，組織中尿苷的水平對(duì)于嘧啶類(lèi)抗代謝藥物的抗腫瘤治療至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)癌組織中尿苷含量高于上皮組織而低于肌肉組織（P<0.001,圖3 A1和A3），而尿嘧啶的含量在癌組織中顯著升高（P<0.001,圖3 A2和A4），尿嘧啶/尿苷離子強(qiáng)度比（圖3A6）在癌區(qū)顯著增加，可以作為區(qū)分癌組織與癌旁正常組織的生物標(biāo)志物。同樣，免疫組化結(jié)果顯示催化尿嘧啶生成尿苷的代謝酶尿苷磷酸化酶1(UPase 1)在癌組織中的表達(dá)上調(diào)。
圖3A 尿苷代謝途徑中關(guān)鍵代謝物和代謝酶的原位分析（A1，A2）尿苷和尿嘧啶的質(zhì)譜成像圖 （A3，A4）256例鱗片狀食管癌（ESCC）患者癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中尿苷和尿嘧啶水平 ***p<0.001（A5）UPase 1介導(dǎo)的尿苷轉(zhuǎn)換為尿嘧啶的代謝過(guò)程（A6）根據(jù)尿嘧啶/尿苷離子強(qiáng)度比值構(gòu)建的質(zhì)譜成像圖 （A7）癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中尿苷和尿嘧啶的強(qiáng)度變化（A8）ESCC不同區(qū)域UPase 1的表達(dá) CT，癌組織；ET，上皮組織；MT，肌肉組織
組氨酸在組氨酸脫羧酶(HDC)的介導(dǎo)下代謝為組胺。有越來(lái)越多的證據(jù)顯示組胺直接參與致癌作用，可以作為一種潛在的細(xì)胞保護(hù)劑來(lái)改善癌癥治療。根據(jù)一些研究者的說(shuō)法，基于組胺的治療能促進(jìn)癌細(xì)胞中DNA損傷、凋亡和衰老并可以顯著增加患癌動(dòng)物的存活率。在本研究中，組氨酸和組胺呈現(xiàn)完全相反的空間分布。根據(jù)256例食管癌組織樣本的成像數(shù)據(jù)，組氨酸在癌組織中顯著上調(diào)而組胺顯著下調(diào)。組胺與組氨酸的離子強(qiáng)度差異如圖3B7所示。通過(guò)計(jì)算組胺與組氨酸的離子強(qiáng)度比，對(duì)HDC介導(dǎo)的組氨酸脫羧反應(yīng)進(jìn)行了研究(3B6)，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的脫羧率相對(duì)于肌肉和上皮組織較弱。和基于強(qiáng)度比的質(zhì)譜成像預(yù)測(cè)的一致，腫瘤組織的HDC表達(dá)水平低于肌肉組織和上皮組織。
圖3B 組胺代謝途徑中關(guān)鍵代謝物和代謝酶的原位分析 （B1，B2）組氨酸和組胺質(zhì)譜成像圖（B3，B4）256例鱗片狀食管癌（ESCC）患者癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中組氨酸和組胺水平 （B5）HDC介導(dǎo)的組氨酸轉(zhuǎn)換為組胺的代謝過(guò)程（B6）根據(jù)組胺/組氨酸離子強(qiáng)度比值構(gòu)建的質(zhì)譜成像圖（B7）癌組織和相鄰上皮、肌肉組織中組氨酸和組胺的離子強(qiáng)度變化（B8）ESCC不同區(qū)域HDC的表達(dá)。此外，發(fā)生改變的代謝途徑還有谷氨酸代謝，脂肪酸合成以及多胺的生物合成，均在腫瘤組織中表現(xiàn)為顯著增多，相應(yīng)的免疫組化結(jié)果也證明與上述途徑有關(guān)的關(guān)鍵代謝酶在癌區(qū)的表達(dá)也明顯上調(diào)。以下（表1）為通過(guò)256例食管癌患者組織樣本篩選出的發(fā)生改變的6條代謝途徑和相應(yīng)的關(guān)鍵代謝酶：
表1 篩選出癌癥相關(guān)的代謝產(chǎn)物、代謝酶、代謝途徑
該研究建立了一種高靈敏的空間分辨的原位代謝組學(xué)方法，對(duì)食管癌潛在原位標(biāo)志物進(jìn)行了代謝通路分析，并對(duì)通路上相關(guān)聯(lián)代謝物的分布特征進(jìn)行原位可視化表征，分析其空間變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)了并驗(yàn)證了6個(gè)在食管癌中異常表達(dá)的代謝酶：吡咯-5-羧酸還原酶2(PYCR2)、谷氨酰胺酶(GLS)、尿苷磷酸化酶1(UPase1)、組氨酸脫羧酶(HDC)、脂肪酸合成酶(FASN)和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)，它們廣泛參與食管癌相關(guān)的腫瘤代謝過(guò)程，其中PYCR2和UPase1被首次發(fā)現(xiàn)在食管癌中異常改變。研究結(jié)果表明脯氨酸生物合成，谷氨酸代謝，尿苷代謝，組氨酸代謝，脂肪酸合成，多胺生物合成等代謝通路在食管癌組織中發(fā)生了顯著變化。這些癌癥代謝相關(guān)信息有助于增加對(duì)癌癥代謝重編程的理解?；贏FADESI-MSI技術(shù)的空間分辨原位代謝組學(xué)方法，不僅可驗(yàn)證腫瘤原位標(biāo)志物的可靠性；同時(shí)針對(duì)腫瘤等具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的組織，它具有原位、無(wú)需特殊標(biāo)記、無(wú)需復(fù)雜耗時(shí)的前處理及反復(fù)染色過(guò)程，能夠高通量地發(fā)現(xiàn)腫瘤異常變化的代謝通路及其代謝酶等優(yōu)勢(shì)；可從代謝物和代謝酶兩個(gè)層次全面表征腫瘤的代謝改變并發(fā)現(xiàn)其潛在功能，為深入探究腫瘤的代謝改變提供了全新的研究視角。
數(shù)據(jù)來(lái)源：“質(zhì)譜成像”微信公眾號(hào)
中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室再帕爾·阿不力孜、賀玖明團(tuán)隊(duì)在《Theranostics》上發(fā)表了一篇題為“Evaluation of the tumor-targeting efficiency and intratumor heterogeneity of anticancer drugs using quantitative mass spectrometry imaging”的研究論文，采用空氣動(dòng)力輔助解吸電噴霧離子化（AFADESI）技術(shù)和基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）的虛擬校正-定量質(zhì)譜成像（VC-QMSI）方法，建立了針對(duì)紫杉醇及其衍生物前藥的體內(nèi)定量成像方法，為評(píng)估該類(lèi)藥物的腫瘤靶向效率和瘤內(nèi)異質(zhì)性分布提供了直觀有效的途徑，也為靶向抗腫瘤新藥研發(fā)提供了有力的研究工具。（文章鏈接：doi: 10.7150/thno.41763. eCollection 2020.）
可區(qū)分正常組織和腫瘤組織的靶向抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)是癌癥治療研究中的關(guān)鍵問(wèn)題。在新藥研發(fā)的早期，如何快速評(píng)估抗癌藥物的腫瘤靶向性非常重要，且了解藥物在腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性分布更具挑戰(zhàn)。開(kāi)發(fā)一種高精度、高靈敏度的定量成像分析方法有望解決這一難題。質(zhì)譜成像是一種無(wú)需標(biāo)記的分子成像技術(shù)，它可提供有關(guān)生物體內(nèi)藥物和代謝物分布的時(shí)空信息，其在藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用正在迅速增加。紫杉醇具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，但直接用藥常伴隨有骨髓抑制、神經(jīng)毒性等嚴(yán)重不良反應(yīng)；近年來(lái)臨床致力于對(duì)紫杉醇進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化、劑型改造或前體藥物開(kāi)發(fā)，以提高藥物的腫瘤靶向能力，減少副作用。本研究建立了紫杉醇及其衍生物前藥的體內(nèi)定量成像方法，評(píng)估了該類(lèi)藥物的腫瘤靶向效率和瘤內(nèi)異質(zhì)性分布。
通過(guò)構(gòu)建含已知濃度藥物的模擬生物組織，建立了定量質(zhì)譜成像標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；采用空氣動(dòng)力輔助解吸電噴霧離子化質(zhì)譜成像（AFADESI-MSI）技術(shù)，同時(shí)采集藥物、藥物代謝物和內(nèi)源性代謝物信息；以?xún)?nèi)源性代謝物為內(nèi)標(biāo)，結(jié)合ANN方法，構(gòu)建了生物組織中質(zhì)譜響應(yīng)基體效應(yīng)自動(dòng)預(yù)測(cè)與校正的回歸模型，對(duì)動(dòng)物切片的單位像素進(jìn)行逐一定量，從而建立了整體動(dòng)物體內(nèi)藥物質(zhì)譜成像分析方法。將該方法用于評(píng)估靜脈注射紫杉醇（PTX）、紫杉醇脂質(zhì)體（PTX-liposome）和紫杉醇前藥（PTX-R）在A549細(xì)胞異種移植裸鼠中的靶向效率和瘤內(nèi)的分布異質(zhì)性。
該策略的步驟如下：采用含有相同藥量的不同類(lèi)型的模擬組織，篩選出與藥物響應(yīng)強(qiáng)度變化緊密相關(guān)的內(nèi)源性代謝物，并建立藥物的相對(duì)響應(yīng)強(qiáng)度（相對(duì)校正因子RCF）與內(nèi)源性代謝物離子強(qiáng)度之間的ANN模型（圖1A）。根據(jù)該模型自動(dòng)預(yù)測(cè)整體動(dòng)物切片中每個(gè)像素的RCF值(RCFpredicted)，并根據(jù)公式Intensitycal = Intensity /RCFpredicted獲得校正后的藥物響應(yīng)強(qiáng)度（Intensitycal）。將校正響應(yīng)值用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)從未校正的0.45增至校正后的0.99（圖1C）。 使用校正后的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定整體動(dòng)物體內(nèi)的藥物絕對(duì)含量。此外，該方法利用豐富的內(nèi)源性代謝物質(zhì)譜信息，通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)可自動(dòng)識(shí)別動(dòng)物體內(nèi)的生理分區(qū)（圖1D）；它可替代需在光學(xué)或H&E染色指導(dǎo)下的人工分區(qū)方法。綜上，VC-QMSI可用于復(fù)雜的整體動(dòng)物樣本中藥物的空間分辨定量分析（圖1E）。
圖1 VC-QMSI策略在整體動(dòng)物組織中準(zhǔn)確定位抗腫瘤藥物的過(guò)程示意圖 （A）基于內(nèi)源性代謝物的機(jī)器學(xué)習(xí)方法預(yù)測(cè)相對(duì)校正因子的示意圖 （B）不同器官的相對(duì)校正因子成像以及相對(duì)校正因子預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的比較；縮寫(xiě)：H心臟，Li肝臟，Sp脾，Lu肺，K腎，Br大腦，M肌肉，Tu腫瘤 （C）以藥物含量-未校正的藥物響應(yīng)強(qiáng)度構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和以藥物含量-校正后的藥物響應(yīng)強(qiáng)度構(gòu)成的虛擬校正標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)比 （D）通過(guò)使用K均值和t-SNE聚類(lèi)分析進(jìn)行自動(dòng)像素標(biāo)記的整體動(dòng)物分割圖像 （E）整體動(dòng)物體內(nèi)藥物定量的可視化結(jié)果以及光學(xué)圖像
PTX組和PTX-liposome組：PTX在動(dòng)物體內(nèi)呈廣泛分布，在心、肝、脾、肺、腎、肌肉、腸、胃和腫瘤組織中均有分布；在健康組織中的含量遠(yuǎn)高于PTX-R組；給藥后期可觀察到PTX在胃腸道中大量積累，而在腎組織中幾乎不見(jiàn)，提示PTX可能主要通過(guò)膽汁-糞便途徑排泄。PTX-R組：與前兩組的廣泛分布不同，PTX-R主要分布于腫瘤組織，其次是肺和腸。三組小鼠腦中均沒(méi)有明顯的藥物分布。就24h內(nèi)的腫瘤組織藥物暴露量而言，PTX-R組與PTX-liposome組相當(dāng)，是PTX組的2倍；以PTX組為參比，PTX-R組的相對(duì)靶向效率（RTE）是PTX-liposome組的近50倍。以上證明PTX-R有良好的腫瘤靶向能力。
圖2 三個(gè)給藥組在不同時(shí)間點(diǎn)的AFADESI-MSI可視圖（A）PTX在整體動(dòng)物體內(nèi)的時(shí)空和定量分布（B）PTX在腫瘤組織中的時(shí)空和定量分布
腫瘤根據(jù)形態(tài)學(xué)的異質(zhì)性可分為不同的微區(qū)（圖A，B）?；诖x物特征采用t-SNE和k-means等手段得到的腫瘤微區(qū)自動(dòng)識(shí)別的結(jié)果（圖C）與H＆E染色結(jié)果（圖A）高度一致。PTX-R在腫瘤壞死區(qū)域和膠原蛋白區(qū)域的含量明顯高于腫瘤薄壁組織區(qū)域（圖D，E, F），表明PTX-R具有出色的腫瘤穿透能力。對(duì)比腫瘤的薄壁組織和間質(zhì)區(qū)域，PTX-R更多地積累于腫瘤中未明顯分化的區(qū)域，比如腫瘤的膠原蛋白區(qū)域和脂肪組織。這種藥物在腫瘤微區(qū)分布的異質(zhì)性值得進(jìn)一步研究，它對(duì)于認(rèn)識(shí)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、對(duì)藥物的敏感性以及預(yù)后均有重要作用。
圖3 PTX-R在瘤內(nèi)的異質(zhì)分布（A）腫瘤組織的H＆E染色圖像（B）放大倍數(shù)（×20）的代表性腫瘤微區(qū)（C）基于代謝物譜的腫瘤微區(qū)的t-SNE空間分布（D）PTX-R在腫瘤微區(qū)中的分布（E）藥物離子成像和H＆E染色成像之間的耦合匹配疊加圖（F）腫瘤微區(qū)中PTX-R的定量分布
采用無(wú)需標(biāo)記的AFADESI和VC-QMSI技術(shù)成功建立了針對(duì)紫杉醇及其前藥的定量質(zhì)譜成像方法，評(píng)估了該類(lèi)抗腫瘤藥物的腫瘤靶向效率和瘤內(nèi)分布異質(zhì)性，并提供了直觀的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明設(shè)計(jì)的紫杉醇前藥具備優(yōu)異的腫瘤蓄積能力和低全身毒性。進(jìn)一步證明AFADESI-MSI技術(shù)具有高靈敏和寬覆蓋的特點(diǎn)，可在整體動(dòng)物的體內(nèi)微區(qū)同時(shí)可視化各種類(lèi)型的藥物、代謝物和內(nèi)源性代謝物。VC-QMSI方法將內(nèi)源性代謝物作為內(nèi)標(biāo)，建立ANN模型；根據(jù)模型預(yù)測(cè)每個(gè)像素的RCF值，并校正藥物離子強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)藥物在整體動(dòng)物和亞器官組織中的定量可視化。紫杉醇前藥及其代謝物的體內(nèi)定量分布研究有助于從藥物的保留、消除、靶向和釋放四個(gè)角度設(shè)計(jì)有效的腫瘤靶向藥物。所建方法有助于預(yù)測(cè)與藥物分布相關(guān)的藥效和安全性，在抗腫瘤藥物研發(fā)早期進(jìn)行直接快速的藥效篩查，減少損耗、降低成本。此外，本研究對(duì)闡明藥物的功效、毒性和耐藥性提供了一個(gè)深入的視角，有助于抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)和優(yōu)化。
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